鲎(Horseshoe crab), 隶属于节肢动物门(Arfhropoda)、肢口纲(Merostomata)、剑尾目(Xiphosura), 世界上只有中国鲎和美洲鲎可以生产鲎试剂, 所以按来源鲎试剂可分为两种, 一种是中国鲎试剂(Tachypleus amebocyte lysate, 缩写为TAL), 原材料为中国鲎血液; 另一种是美洲鲎试剂(Limulus amebocyte lysate, 缩写为LAL), 提取自美洲鲎的血液[1]。中国鲎是我国生产鲎试剂重要的海洋药用生物资源。目前采集鲎血比较常规的方式主要是人们趁着鲎靠近海岸交配时将其捕获, 采集1/5~1/3的血量, 每只鲎大约采100 mL血液, 采完血的鲎在当天带到距被捕地大约120 km的地方放生, 防止短时间再次被捕采血。研究显示适量采血不会影响鲎的生活和生殖能力, 但需要足够的时间才能使采血鲎恢复健康[2]。即便在操作较为规范的美国, 对鲎的生存依然存在较大的影响。研究人员在马萨诸塞州的海湾针对美洲鲎做了实验, 采血即便不会致命, 但也会影响美洲鲎活动水平、运动速度和潮汐节律表现, 这些变化可能会干扰美洲鲎的活动以及产卵, 也会让雌鲎降低交配几率, 并追踪到有18%的美洲鲎在采血后死亡。与美洲鲎相比, 中国鲎面临着更大的威胁, 采血不规范、放生保护措施不到位、过度取血, 甚至直接把鲎血抽干, 这些杀鸡取卵式的采血方法造成很多被采血的中国鲎难逃一死。中国鲎从受精卵至性成熟需要13~15年的时间[3], 种群数量恢复缓慢, 由于市场对鲎试剂巨大的需求, 导致中国鲎的种群数量持续下降。
中国鲎的一些种群已经从它们原来的活动范围内消失了, 包括中国的台湾、香港、浙江、福建以及日本的海岸线[4-5]。珠江口以北的海域已很难发现中国鲎, 北部湾海域成为中国鲎最后的栖息地, 但数量也在快速减少。1990年以前北部湾海域成年中国鲎的数量可达60~70万对, 到2000年已降至约30万对[6]。根据广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室的调查, 目前, 广西北部湾海域成年的中国鲎数量仅为1万对左右, 资源几近枯竭。2019年3月23日, 中国鲎在世界自然保护联盟(IUCN)红色名录里的等级从原本的数据缺乏(DD)更新为濒危(EN)[7]。作为濒危物种, 同时又面对巨大的市场需求, 改变传统的采血方式, 开展人工养殖条件下的中国鲎可持续性采血已势在必行。这就需要把在自然海域捕获的中国鲎驯养在池塘中, 然后定期定量对鲎进行采血, 并确保鲎的成活率, 提高鲎的利用率, 实现可持续性多次采血, 从而减少中国鲎的捕获量, 以保护中国鲎的种群数量不再减少。
由于中国鲎在养殖与采血过程中会受到气候、水质、摄食等多种因素的影响, 血液的再生与恢复并非总是一样的, 如果采血以后中国鲎的血液没有得到很好的恢复而继续按照原来的计划定期定量采血, 势必直接影响到中国鲎的健康甚至造成其死亡。因此, 针对人工养殖条件下的中国鲎可持续性采血, 亟须建立一种简便、高效、快捷的基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中国鲎
把从北部湾海域捕获的中国鲎暂养在海边的水塘中2星期, 然后随机捕捞9只体长30 cm左右、体重300 g左右、年龄大约4~5岁的雄性中国鲎转移至实验室的循环水养殖系统中, 分别标记为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9。养殖用水取自广西三娘湾海域的海水, 盐度25, 养殖温度26~28 ℃, 每周投喂鱼肉2次。
1.1.2 试剂
双缩脲法蛋白含量检测试剂盒BC3185: 规格100管/96样, 购买自北京索莱宝科技有限公司。
Cu(GSBG62024-90)、Fe(GSBG62020-90)、Zn (GSBG62025-90)、Mn(GSBG62019-90)、Cd(GSB04-1721-2004)、Cr(GSBG62017-90)、Pb(GSB04-1742-2004)标准溶液: 规格50 mL, 元素含量1 000 μg/mL购买自国家钢铁材料测试中心钢铁研究总部。
抗凝剂: 用茶碱(≥98%)和NaCl配制盐度25、茶碱物质的量浓度0.5 mol/L的溶液作为抗凝剂。
1.2 方法
1.2.1 取样
中国鲎在实验室静养4周后进行取样, 把中国鲎放入经紫外线灭菌的超净台内, 用碘伏消毒液对其背侧胸腹连接处的心门位置消毒处理, 然后用75%的乙醇擦去碘伏。取20 mL的无菌注射器先吸入10 mL的抗凝剂, 用注射针头从胸腹关节处刺入心门, 抽取血液10 mL, 混匀备用。
1.2.2 血细胞计数
血细胞计数板及相关用品180 ℃烘干6 h, 取鲎血样品经抗凝剂稀释后滴入血细胞计数板, 在显微镜下计数, 重复3次, 取平均值得中国鲎血细胞数量(BBC)。
1.2.3 血浆蛋白与血淋巴蛋白的检测
多功能酶标仪预热30 min以上, 调节波长至540 nm, 蒸馏水调零。取中国鲎血样品1 mL放入经灭菌处理的离心管10 000 r/min离心10 min, 按照双缩脲法蛋白含量检测试剂盒说明书的要求, 制备空白管、标准管, 用鲎血和血浆分别制备测定管, 每个样品制备3个测定管, 然后用酶标仪测定并计算蛋白含量, 取3个重复的平均值, 即为血浆蛋白含量(PPC)。取中国鲎血样品直接按上述方法检测, 即为血淋巴蛋白含量(BPC)。
1.2.4 微量元素和重金属的测定
精确称取鲎血样品10 mL, 把样品放入坩埚中, 在电炉上小火加热, 炭化至无烟, 转移至马弗炉中, 500 ℃恒温灰化5 h, 然后加入适量1︰1的盐酸溶解后定容至10 mL, 用AA-7000系列原子吸收光谱仪火焰法测定铜元素含量。
1.2.5 统计分析
采用WPS2019表格对实验数据进行整理、统计, 采用SPSS22进行相关性分析。
2 结果与分析
2.1 中国鲎血液质量指标检测结果
中国鲎血液质量指标检测结果见表 1, 中国鲎血液中Cu含量为0.94~18.00 mg/L, 平均(8.33±5.82) mg/L; 血细胞数为2.80×103~22.00×103个/mL, 平均(13.31± 5.46)×103个/mL; 血浆蛋白含量为2.26~15.42 mg/mL, 平均(8.54±4.54) mg/mL; 血淋巴蛋白含量为2.54~ 12.99 mg/mL, 平均(7.07±3.70) mg/mL。
表 1 中国鲎血液质量指标检测结果(n=9) Tab. 1 Test results of Tachypleus tridentatus blood quality index (n=9)
检测项目
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
$\bar x \pm sd$
铜含量/(mg·L–1)
18.00
11.60
2.80
10.40
12.20
11.30
6.50
1.24
0.94
8.33±5.82
血细胞数/(×103 mL–1)
22.00
16.57
11.33
15.87
15.97
15.17
10.00
10.10
2.80
13.31±5.46
血浆蛋白含量/(mg·mL–1)
15.42
11.93
4.30
10.43
11.10
11.10
7.31
3.01
2.26
8.54±4.54
血淋巴蛋白含量/(mg·mL–1)
12.99
9.87
3.18
8.51
8.13
9.90
5.61
2.88
2.54
7.07±3.70
表选项
2.2 中国鲎血液质量指标相关性分析
中国鲎血液质量指标相关性与显著性见表 2, 中国鲎血液中铜元素含量、血细胞数、血浆蛋白含量以及血淋巴蛋白含量等4种血液质量指标相互间均呈极显著相关。
表 2 中国鲎血液质量指标相关性与显著性(n=9) Tab. 2 Correlation and significance of blood quality indexes in Tachypleus tridentatus (n=9)
血液质量指标
相关性与显著性
铜含量
血细胞数
血浆蛋白含量
血淋巴蛋白含量
铜含量
相关性R
1.000
0.917**
0.995**
0.983**
显著性P
—
0.001
0.000
0.000
血细胞数
相关性R
1.000
0.924**
0.903**
显著性P
—
0.000
0.001
血浆蛋白含量
相关性R
1.000
0.988**
显著性P
—
0.000
血淋巴蛋白含量
相关性R
1.000
显著性P
—
注: **表示相关性极显著; —表示不作显著性分析
表选项
2.2.1 血液中铜含量与血细胞数的相关关系
由表 1、2和图 1可知, 中国鲎血液中铜含量与血细胞数呈极显著相关, 其换算关系为:
$
Y_1=6.14+0.86 X,
$
(1)
图 1 中国鲎血液中铜含量与血细胞数的相关关系 Fig. 1 Correlation between blood copper content and blood cell count in Tachypleus tridentatus
图选项
式中, Y1为中国鲎血细胞数(×103/mL), X为中国鲎血液中铜含量(mg/L)。
2.2.2 血液中铜含量与血浆蛋白含量的相关关系
由表 1、2和图 2可知, 中国鲎血液中铜含量与血浆蛋白含量呈极显著相关, 其换算关系为:
$
Y_2=2.08+0.78 X,
$
(2)
图 2 中国鲎血液中铜含量与血浆蛋白含量的相关关系 Fig. 2 Correlation between blood copper content and plasma protein content in Tachypleus tridentatus
图选项
式中, Y2为中国鲎血浆蛋白含量(mg/mL), X为中国鲎血液中铜含量(mg/L)。
2.2.3 铜含量与血淋巴蛋白含量的相关关系
由表 1、2和图 3可知, 中国鲎血液中铜含量与血淋巴蛋白含量呈极显著相关, 其换算关系为:
$
Y_3=1.87+0.62 X,
$
(3)
图 3 中国鲎血液中铜含量与血淋巴蛋白含量的相关关系 Fig. 3 Correlation between blood copper content and hemolymph protein content in Tachypleus tridentatus
图选项
式中, Y3为中国鲎血淋巴蛋白含量(mg/mL), X为中国鲎血液中铜含量(mg/L)。
3 讨论
3.1 中国鲎血液质量监测方法可以推动可持续采血技术的发展与完善
在鲎试剂的研究报道中, 一方面在鲎试剂对内毒素的作用机理与鲎试剂的生产等研究领域, 周海钧报道了鲎试剂对内毒素凝集作用的机理, 说明用东方鲎试剂代替常规的家兔法检测注射液中的热原在理论上是可行的[8]。刘端华等报道了东方鲎试剂质量和中试工艺的研究[9]。李桂香等开展了鲎试剂法对血液保养液热原的检测, 取得良好效果[10]。王志光等建立了一种从商品化中国鲎试剂中快速分离凝固蛋白原的方法[11]。孙萍等比较了鲎试剂法与家兔法测定刺五加注射液热原, 结果证明鲎试剂法不仅快速、简单、准确灵敏, 而且经济方便[12]。罗茵等报道了细菌内毒素分析仪利用从东方鲎血液中提取C因子、G因子和凝固酶原等活性成分, 分别于血液细菌内毒素和真菌葡聚糖产生凝聚反应, 判断革兰氏阴性细菌和真菌感染程度, 鲎试剂已成为细菌内毒素检查法的重要试剂[13]。
另一方面, 对于中国鲎的人工养殖与定期采血制取鲎试剂的研究也有部分报道, 吴伟洪等的实验表明把捕捉到的中国鲎进行人工饲养, 定期抽血制备鲎试剂是可行的[14]。李建鑫研究了鲎的人工养殖及鲎试剂的制备[15]。顾功超尝试了在人工饲养条件下连续抽血制取鲎试剂是可行的[16]。梁广耀等经过16个月的人工养殖和反复抽血, 表明只要抽血量合理和抽血间隔时间恰当, 鲎的存活率和变形细胞数都比较接近对照组的数据, 说明完全可以达到反复采血抽取鲎试剂的目的[17]。刘端华等用人工饲养的鲎抽血制备鲎试剂, 在第一次抽血后, 血液中变形细胞就有减少的趋势, 经三次抽血后变形细胞数显著减少, 同时血液颜色变淡, 甚至变成白色, 这意味着无法多年人工饲养抽血[18]。到目前为止, 尚未见到在鲎试剂生产过程中对中国鲎血液质量进行监测的相关报道。由于对中国鲎是否能够连续采血存在完全相反的结论, 所以, 建立基于鲎试剂生产的中国鲎血液质量的监测方法, 不但可以减少不当采血对中国鲎健康造成的影响, 而且可以推动中国鲎可持续采血技术的发展与完善, 促进鲎试剂生产向更加科学、规范的方向发展, 对中国鲎的利用与保护具有重要意义。
3.2 中国鲎血液质量监测指标的选择
中国鲎的血液通常称为血淋巴, 血淋巴由血细胞和血浆组成。血细胞包括两种, 即占比达99%的血细胞和少量的血蓝细胞, 血细胞也称颗粒细胞, 成年鲎只含有血细胞。鲎的血细胞中含有能与内毒素起凝集作用的酶系统, 可以用于生产鲎试剂, 因此, 鲎血中的血细胞数量不但反映了鲎的血液恢复状态, 也决定了鲎试剂生产的效率。血浆是血细胞的载体, 对内环境的稳态起着决定性作用。血浆蛋白包括血蓝蛋白、α2-巨球蛋白、C-反应蛋白, 其中血蓝蛋白是一种可溶性的呼吸蛋白, 占血浆蛋白的90%~ 95%。铜元素是血蓝蛋白的重要组成成分, 血蓝蛋白的每个氧结合位点有2个铜离子, 血液中铜的含量能够准确反映血蓝蛋白的含量。因此, 选择中国鲎血液中铜元素含量、血细胞数、血浆蛋白含量以及血淋巴蛋白含量作为监测中国鲎的血液质量指标。
3.3 中国鲎血液中铜含量作为质量监测指标的可行性
中国鲎的血细胞具有容易凝集的特点, 在进行中国鲎血细胞计数时要求全程无菌操作, 实验条件较为苛刻, 稍有不慎就可能影响实验结果。即使严格地执行无菌操作, 如果多次采血, 中国鲎的血细胞也同样可能出现凝集, 影响血细胞计数。而血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量的检测需要购买试剂盒进行生化反应, 对实验设备和实验条件要求较高, 同时需要消耗大量的试剂盒等材料, 还要付出人力成本和时间成本。铜元素是血蓝蛋白的重要组成成分, 血蓝蛋白的每个氧结合位点有2个铜离子, 血液中铜的含量能够准确反映血蓝蛋白的含量。但是, 如果在生产鲎试剂的过程中全部监测上述4种指标, 无疑会给生产企业造成沉重的负担。既能准确反映中国鲎血液质量的变化情况, 又能简化流程, 减少人力、物力以及财力的消耗就显得尤其重要。
在本实验中, 中国鲎血液中铜元素含量、血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量等数值均出现了较大波动, 可能是由于实验所用的中国鲎经历了从大海到池塘、从池塘到实验室的不同的养殖环境, 由于不同个体对新的环境适应能力不同而造成了的差异。但各指标之间的相关关系均呈极显著相关, 说明这种数量的波动是中国鲎个体差异造成的, 而不是实验误差的影响。
血液中铜含量不但能够直接反映血蓝蛋白的含量, 而且由于铜含量与血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量等指标均呈现极显著相关性, 可以换算成血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量。与上述几种指标的检测方法相比, 铜元素的检测不会受到血液变质、细胞凝集等因素的干扰, 检测方法除了原子吸收光谱法以外, 还可以采用电化学分析法, 检测设备价格更低, 检测条件更容易实现。所以, 选择血液中铜含量来监测中国鲎血液质量是可行的。
4 结论
中国鲎血液中铜含量不但能够直接反映血蓝蛋白的含量, 而且由于铜含量与血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量等指标均呈现极显著相关性, 可以换算成血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量。因此, 以中国鲎血液中铜含量作为监测血液质量的指标, 具有简便、高效、快捷、省时、省力和省钱的特点。在鲎试剂生产中对中国鲎血液质量进行监测可以减少不当采血对中国鲎健康造成的影响, 对中国鲎的利用与保护具有重要意义。